甘草酸、甘草次酸衍生物体外抗肿瘤活性研究

摘要：目的  查阅文献，发现甘草次酸（GA）碳30位连接苄基会提高其抗肿瘤活性[1]，所以本文在苄基的不同位置分别连接氟、氯和硝基，探讨是否会进一步提高其抗肿瘤活性。方法 以GA、苄溴或含氟、氯、硝基苄溴为原料，在碱性条件下，生成一系列酯；采用CCK-8法测试其对细胞A549、Hela、HepG2、MCF-7、MDCK[NBL-2]的毒性。结果 GA衍生物对五种细胞表现出不同的毒性。结论 甘草酸（GL）、化合物1和9可作为潜在抗肿瘤药物被进一步研究。

关键词：甘草酸；甘草次酸；衍生物；抗肿瘤

恶性肿瘤严重威胁人类的生命并降低生活质量， 世界卫生组织统计数据表明，2020年全球新发癌症病例1929万例，死亡病例996万例，是目前世界上主要的公共卫生问题之一[2]。近年来，对从天然产物中提取分离得到的有效成分进行结构修饰已成为国内外抗肿瘤药物研究的热点[3-4]。五环三萜类化合物因其具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗HIV、保肝、免疫辅助等生物活性而受到广泛关注[5]。在甘草次酸的C-30处引入苄基可显著提高其抗肿瘤活性[1]。本研究以甘草次酸为母核，合成出10个结构新颖的GA衍生物，CCK-8法评价了其体外抗肿瘤活性，筛选出优势化合物。经查询Reaxys数据库，除化合物1被研究较多外，其他化合物较少研究。所以本文研究有一定的必要性。

1  仪器与材料 

1.1  主要仪器  X-5型显微熔点测定仪；Bruker Avance 400型核磁共振仪；Waters G2-Xs qtof型质谱仪；Multiskan FC型酶标仪；ECLIPSE Ts2-FL型倒置荧光显微镜。

1.2   主要试药  18β-甘草次酸（GA，质量分数98%，上海华东）；甘草酸（GL，质量分数93%）、溴化苄及其衍生物均为罗恩试剂；5-氟尿嘧啶（5-FLU，质量分数99%，麦克林试剂）；CCK-8（Phygene试剂）；1×PBS缓冲液（细胞培养）（biosharp试剂）；细胞完全培养基、特级胎牛血清、细胞株 A549、Hela、HepG2、MCF-7、MDCK[NBL-2]均购自武汉尚恩生物技术有限公司。

2  方法

2.1  化合物1~10的制备

将GA（0.6g, 1.27mmol）和溴化苄（118μL, 1mmol）， 置于50mL茄形反应瓶中，加入DMF5mL, 待溶解后，加入无水碳酸钾（0.35g, 2.53mmol）， 常温下反应过夜，薄层色谱（TLC）监测溴化苄反应完全，停止反应，用乙酸乙酯和弱碱水萃取，得化合物1。同法操作，将溴化苄换成溴化苄衍生物，保持GA过量，得化合物2至10.

化合物1 R1=H,R2=H,R3=H; 化合物2 R1=F,R2=H,R3=H; 化合物3 R1=H,R2=F,R3=H; 化合物4

R1=H,R2=H,R3=F;化合物5 R1=Cl,R2=H,R3=H; 化合物6 R1=H,R2=Cl,R3=H; 化合物7 R1=H,R2=H,R3=Cl; 化合物8 R1=NO2,R2=H,R3=H;化合物9 R1=H,R2=NO2,R3=H; 化合物10 R1=H,R2=H,R3=NO2

图1 化合物1~10的合成路线

2.2  体外抗肿瘤活性筛选  

2.2.1 、CCK-8实验  取处于对数生长期的细胞接种于96孔板中培养。24小时后加药，每组设置3个复孔，继续培养24小时后CCK-8，测定吸光度值A。采用Graphpad Prism 10.1软件计算半数抑制浓度IC50值。

2.2.2、 划痕实验  使用无菌的 200μL枪头，垂直于培养板底部细胞层表面，轻轻地划一道直线，形成“划痕”，添加药物，在形成划痕0小时、24小时、48小时后观察迁移情况。

3  结果

3.1  结构鉴定

采用400MHz和101MHz的核磁共振仪器，以氘代氯仿为溶剂，对样品进行氢原子核和碳原子核进行分析。化合物1 白色固体，收率为59.5%；熔程为119.7~121.7℃；1H NMR δ 7.42–7.28(m,5H,H-3΄,4΄,5΄,6΄,7΄).13C NMR δ 128.91–128.20(m,6C,C-3΄,4΄,5΄,6΄,7΄,12).HRMS (ESI) m/z:[M+Na]+ calcd for C37H52O4Na 583.3764,found 583.3768.化合物2 白色固体，收率为60.7%；熔程为189.5~190.3℃；1H NMR δ 7.42–7.28(m,2H,H-5΄,7΄).13C NMR δ 161.16(d, J =248.6Hz,C-3΄).HRMS (ESI) m/z:[M+Na]+ calcd for C37H51O4NaF 601.3669,found 601.3672. 化合物3 白色固体，收率为76.4%；熔程为152.6~153.4℃；1H NMR δ 7.39–7.29(m,1H,H-6΄). 13C NMR δ 162.91(d, J=246.5Hz,C-4΄).HRMS (ESI) m/z:[M+Na]+ calcd for C37H51O4NaF 601.3669,found 601.3673.化合物4 白色固体，收率为54.3%；熔程为163.1~164.5℃；1H NMR δ 7.38–7.29(m,2H,H-3΄,7΄).13C NMR δ 162.76(d, J=247.0Hz,C-5΄). HRMS (ESI) m/z:[M+Na]+ calcd for C37H51O4NaF 601.3669,found 601.3674.化合物5 白色固体，收率为74.1%；熔程为202.3~203.9℃；1H NMR δ 7.47–7.36(m, 2H, H-6΄,7΄). 13C NMR δ 133.80(C-3΄).HRMS (ESI) m/z:[M+Na]+ calcd for C37H51O4NaCl 617.3374,found 617.3378.化合物6 白色固体，收率为57.5%；熔程为153.3~155.2℃；1H NMR δ 7.36–7.20(m,4H,H-3΄,5΄,6΄,7΄).13C NMR δ 134.56 (C-4΄).HRMS (ESI) m/z:[M+Na]+ calcd for C37H51O4NaCl 617.3374,found 617.3377.化合物7 白色固体，收率为65.1%；熔程为131.6~133.8℃；1H NMR δ 7.34(d, J=8.5Hz,2H,H-3΄,7΄).13C NMR δ 134.28(C-5΄).HRMS (ESI) m/z:[M+Na]+ calcd for C37H51O4NaCl 617.3374,found 617.3379. 化合物8 淡黄色固体，收率为73.9%；熔程为178.7~180.7℃；1H NMR δ 8.11(dd, J=8.2,1.3Hz,1H,H-4΄).13C NMR δ 147.82(C-3΄).HRMS (ESI) m/z:[M+Na]+ calcd for C37H51NO6Na 628.3614,found 628.3618.化合物9 白色固体，收率为65.6%；熔程为178.6~180.2℃；1H NMR δ 8.19(d, J=1.4Hz,2H,H-3΄,7΄). 13C NMR δ 148.47(C-4΄).HRMS (ESI) m/z:[M+Na]+ calcd for C37H51NO6Na 628.3614,found 628.3610.化合物10 白色固体，收率为44.0%；熔程为168.5~169.3℃；1H NMR δ 8.23(d, J=8.7Hz,H-4΄,6΄). 13C NMR δ 147.83(C-5΄). HRMS (ESI) m/z:[M+Na]+ calcd for C37H51NO6Na 628.3614,found 628.3616.

3.2  体外抗肿瘤活性测定  

3.2.1 、CCK-8实验结果  通过CCK-8实验评价了GL、GA和合成的10种结构新颖的GA衍生物对4种肿瘤细胞的抗肿瘤活性及1种正常细胞的毒性，结果见表1。

表1 化合物对不同细胞的IC50

3.2.2、 划痕实验结果  作用24小时后，药物抑制细胞迁移作用不明显，但作用48小时后，细胞死亡明显。

图2  划痕实验结果

 4  讨论

GA作为抗癌先导化合物受到世界各国科学家的广泛关注，但其抗肿瘤活性并不明显。为了提高GA的细胞毒性，探讨GA的羧基和被不同取代基取代的苄溴连接对抗肿瘤活性的影响，本研究以GA为母核，在C-30位引入2、3、4被氟、氯、硝基取代的苄溴设计并合成10个结构新颖的GA衍生物，利用CCK-8法筛选得到优势化合物1和9，其对人宫颈癌细胞HeLa的抑制作用强于阳性对照药5-FLU，同时对正常犬肾细胞MDCK[NBL-2]的毒性低于5-FLU。研究还发现，GL对人肺腺癌细胞A549的抑制作用强于阳性对照药5-FLU，同时对正常犬肾细胞MDCK[NBL-2]的毒性低于5-FLU，表现出高活性和高选择性。此三种化合物在抗肿瘤活性上和对正常细胞毒性上表现良好，有被开发成药物的潜质，值得继续研究。

参考文献：

[1] 周菲. 甘草次酸衍生物的设计、合成与抗肿瘤活性初步研究[D]. 北京：北京中医药大学, 2020.

[2] Siegel R L, Miller K D, Joumal A. Cancer statistics, 2019[J]. CA Cancer J Clin, 2019, 69(1): 7-34.

[3] Newman D J, Cragg G M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 0l/1981 to 09/2019[J]. J Nat Prod, 2020, 83(3): 770-803.

[4] Petersen F, Natural products based molecules for target and drug discovery in pharmaceutical research[J]. Planta Med, 2017, 4(S 01): S1-S202.

[5] Xu C C, Wang B, Pu Y Q, Tao J S, Zhang T. Techniques for the analysis of pentacyclic  triterpenoids in medicinal plants[J]. J. Sep. Sci. 2018, 41, 6-19.

基金项目：河南省高等学校重点科研项目计划（编号：23B350006）